Abstract:

Versione in italiano:

L'RNA e le proteine interagiscono nelle cellule viventi in varie fasi, regolando processi come trascrizione, splicing e traduzione. L'alterazione delle interazioni RNA-proteina influisce fortemente sull'omeostasi cellulare ed è stata collegata a malattie umane[1]. Il nostro obiettivo è sviluppare una nuova metodologia chiamata PLANS (Proximity Ligation And Nanopore Sequencing) per: i) caratterizzare le interazioni native RNA-proteina che si verificano nelle cellule viventi, comprese le interazioni transitorie e quelle che coinvolgono molecole a bassa abbondanza; ii) identificare le modifiche post-trascrizionali (PTMs) dell'RNA presenti nei trascritti che interagiscono, ampliando il ruolo che le PTM giocano nella regolazione delle interazioni RNA-proteina; iii) sviluppare strumenti predittivi che inferiscano le interazioni RNA-proteina e l'effetto delle PTM sul legame RNA-proteina. PLANS può essere applicato a qualsiasi RBP cellulare di interesse. La proteina selezionata viene fusa con un enzima batterico in grado di promuovere la biotilinizzazione promiscuosa di qualsiasi RNA e proteina nelle sue immediate vicinanze. Gli RNA biotilinizzati vengono quindi sottoposti a sequenziamento diretto dell'RNA mediante Nanopore, analizzando così le molecole di RNA native e le loro PTM.
(WP1). Sfrutteremo PLANS per valutare l'interattoma RNA dei RBP coinvolti nell'endocitosi non clatrinica (NCE) del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) in risposta alla stimolazione con EGF. Queste proteine, che legano i target di RNA attraverso domini di legame RNA canonici e regioni intrinsecamente disordinate (IDRs), sono state trovate come interattori di EGFR in NCE[2]. La caratterizzazione degli RNA legati alle proteine associate a NCE dopo la stimolazione con EGF rivelerà nuovi aspetti che potrebbero essere rilevanti per la risposta fisiologica di EGFR e, se alterati, contribuire a una segnalazione aberrante di EGFR osservata nelle cellule tumorali.
(WP2). Adotteremo PLANS per identificare gli RNA umani modificati dalle enzimi pseudouridina sintasi (PUS). Le enzimi PUS interagiscono temporaneamente con i loro target di RNA e modificano i motivi lineari all'interno di sequenze di consenso specifiche[3, 4]. Attraverso PLANS, il nostro obiettivo è caratterizzare come le enzimi PUS selezionano i loro target di RNA, valutare i trascritti substrati specifici per ciascun enzima e comprendere come altre PTM possano influenzare il riconoscimento del target di RNA. Questi dati forniranno informazioni rilevanti sull'attività delle enzimi PUS che sono state trovate alterate in malattie umane[5].
(WP3). Costruiremo modelli matematici predittivi per identificare le regioni di legame RBP coinvolte nelle interazioni RNA-proteina. Ci concentreremo sulle IDR, che sono caratterizzate dalla mancanza di una struttura tridimensionale fissa e sono conosciute per legare l'RNA tramite interazioni promiscuose multivalenti. Attraverso i dati ottenuti da PLANS nei WP1 e WP2, il nostro obiettivo è definire sequenze di consenso precise delle IDR richieste per il legame all'RNA, così come identificare il contributo che le PTM giocano nelle interazioni RNA-proteina. Le previsioni e i dati sperimentali saranno raccolti in un database pubblico che verrà utilizzato come riferimento per gli studi sulle interazioni RNA-proteina.

English version:

RNA and proteins interact in living cells at various stages, regulating processes such as transcription, splicing and translation. The alteration of RNA-protein interactions strongly affects cellular homeostasis and has been linked to human diseases[1]. We aim at developing a new methodology named PLANS (Proximity Ligation And Nanopore Sequencing) to i) characterize native RNA-protein interactions occurring in living cells, including transient interactions and interactions involving low abundant molecules; ii) identify RNA post-transcriptional modifications (PTMs) present in the interacting transcripts, expanding the role that PTMs play in the regulation of RNA-protein interactions; and iii) develop predictive tools that infer RNA-protein interactions and the effect of PTMs on RNA-protein binding. PLANS can be applied to any cellular RBP of interest. The selected protein is fused to a bacterial enzyme able to promote the promiscuous biotinylation of any RNA and protein in its close proximity. Biotinylated RNAs are then subjected to Nanopore direct RNA sequencing, hence analyzing native RNA molecules and their PTMs.
(WP1). We will exploit PLANS to assess the RNA interactome of the RBPs involved in the epidermal growth factor receptor (EGFR) non-clathrin endocytosis (NCE) in response to EGF stimulation. These proteins, that bind RNA targets through canonical RNA binding domains and intrinsically disordered regions (IDRs), have been found as EGFR interactors in NCE[2]. The characterization of RNAs bound to NCE-associated proteins upon EGF stimulation will unveil new aspects that may be relevant for the EGFR physiological response and, if altered, contribute to aberrant EGFR signaling observed in cancer cells. (WP2). We will adopt PLANS to identify the human RNAs modified by pseudouridine synthase (PUS) enzymes. PUS enzymes transiently interact with their RNA targets and modify linear motifs included within specific consensus sequence[3, 4]. Through PLANS we aim at characterizing how PUS enzymes select their RNA targets, assess the transcript substrates specific to each enzyme and understand how other PTMs can influence the RNA target recognition. These data will bring relevant insights in the activity of PUS enzymes that have been found altered in human diseases[5]. (WP3) We will construct predictive mathematical models to identify RBP-binding regions involved in RNA-protein interactions. We will focus on IDRs, which are characterized by the lack of a fixed three dimensional structure and are known to bind RNA through multivalent promiscuous interactions. Through the data retrieved by PLANS in WP1 and WP2, we aim to define precise consensus sequences of IDRs required for the binding to RNA. As well as to identify the contribution that PTMs play in RNA-protein interactions.The predictions and the experimental data will be collected into a publicly available database that will be used as reference for RNA-protein interaction studies.

Contatti: damiano.piovesan@unipd.it